-------------------------------------------------------------

L'articolo che segue porta la firma dei proff. Vittorio Colizzi e Mauro Piacentini del Dipartimento di Biologia dell'Università di Tor Vergata di Roma pubblicato su Ateneo Notizie n· 1/2 di luglio 1992

-------------------------------------------------------------

L'università di Tor Vergata è coinvolta nella ricerca sull'Aids con diversi gruppi nei settori che vanno dall'epidemiologia alla farmacologia, dalla virologia all'immunologia, dalla diagnostica alla clinica. In questo breve articolo di Ateneo Notizie si vogliono presentare alcune linee di ricerca sulla patogenesi virale sviluppate nel Dipartimento di Biologia necessarie a comprendere le strategie per lo sviluppo di un vaccino contro l'Aids e le relative difficoltà che si stanno incontrando. La ricerca biotecnologica in questo settore sta vivendo un momento critico tra necessità sociale, ottimismo scientifico e realismo economico - industriale. Come preliminare è necessario dare una definizione di etiologia distinguendola da quella di patogenesi. Per etiologia si intende la causa prima di una malattia e nel caso dell'Aids (Sindrome da Immunodeficienza Acquisita) è certamente il virus HIV (Human Immune Deficiency Virus). Per patogenesi si intende l'insieme di meccanismi con cui un agente etiologico (virus

) permette lo sviluppo della malattia. Lo scopo di questo breve articolo è di evidenziare le problematiche relative alla patogenesi dell'Aids e come la comprensione di queste siano essenziali per lo sviluppo di vaccini efficaci.

1. Etiologia virale e risposta immunitaria protettiva.

Il virus HIV è stato accertato essere la causa sufficiente dell'Aids, una patologia del sistema immunitario strettamente legata alla specie umana. Ad ormai quasi dieci anni dalla prima descrizione di questa infezione, è completamente nota l'organizzazione strutturale del virus, la sequenza nucleotidica ed aminoacidica dei geni e delle proteine virali, nonché l'interazione virus - recettore a livello cellulare con le conseguenti modalità di infezione e trasmissione. Queste conoscenze permettono di considerare attualmente l'HIV come il più caratterizzato, così come è divenuto ormai noto a tutti il termine linfocita T, la cellula del sistema immunitario suscettibile all'infezione e responsabile allo stesso tempo della protezione del nostro organismo dalle infezioni e dai tumori. L'individuazione del linfocita T come bersaglio del virus ha sostanzialmente fatto coincidere l'etiologia virale con la patogenesi. Infatti, alcuni degli effetti citopatici diretti indotti da HIV sui linfociti T, quali la lisi cell

ulare e la formazione di sincizi dovuta alla fusione di più cellule, sono ampiamente compatibili con la diminuzione dell'efficienza del sistema immunitario (immunodeficienza) e quindi con la susseguente comparsa di infezioni microbiche e tumori, che rappresentano le cause finali ed occasionali della morte dei pazienti con Aids. Lo sforzo congiunto di virologi, biologi molecolari, immunologi ed infettivologi ha portato nel giro di pochi anni alla messa a punto di metodi diagnostici in grado di identificare soggetti infetti dal virus. Come in altre classiche infezioni virali, l'entrata di HIV induce la comparsa di anticorpi e di linfociti T citotossici (una sottopopolazione che non viene infettata da HIV in quanto non presenta il recettore per HIV) specifici per le proteine virali. La presenza di anticorpi nel siero definisce anche il termine di sieropositività per indicare i soggetti infettati da HIV. Lo sviluppo di anticorpi e linfociti T citotossici ha ovviamente lo scopo di proteggere il nostro organismo d

a HIV limitando l'infezione. In tutte le infezioni, da quelle più comuni (morbillo, rosolia, etc.) a quelle più esoteriche (febbre gialla, etc.), la sieropositività e la protezione rappresentano due facce della medesima medaglia. In altre parole, chi possiede anticorpi antirosolia non viene vaccinato in quanto si presuppone che sia protetto dall'infezione. Questo non si verifica nell'Aids, dove la sieropositività è un indice di infezione, ma non di protezione dal virus. A cosa è dovuto questa dissociazione tra sieropositività e protezione?

2. Patogenesi dell'Aids: dalla mimesi molecolare alla delezione dei linfociti T.

L'identificazione del virus dell'Aids ha consentito la messa a punto di tecniche diagnostiche molecolari basate sulla possibilità di amplificare di molte volte il genoma virale facilitando quindi l'individuazione delle cellule infettate. Con queste tecniche di amplificazione si è osservato che solo 1/1000 dei linfociti di un soggetto sieropositivo risultano infettati dal virus; questa percentuale di linfociti infettati può aumentare nelle fasi più tardive dell'infezione ma difficilmente supera 1/500. Considerando che i linfociti sono cellule che si rinnovano, difficilmente è pensabile che il virus possa essere direttamente responsabile della scomparsa dei linfociti T, caratteristica delle fasi conclamate di Aids. Anche la formazione di sincizi cellulari, cioè la fusione tra una cellula infettata ed altre non infette, non sembra essere un meccanismo in grado di causare la distruzione del sistema immunitario. Infatti i sincizi si osservano facilmente in vitro (dove le cellule infettate sono artificialmente mes

se a stretto contatto) ma molto raramente in vivo. Inoltre, il periodo di tempo che intercorre tra infezione e sviluppo di malattia risulta molto lungo. I 5 - 10 anni necessari per lo sviluppo dell'immunodeficienza contrastano l'ipotesi di un effetto diretto del virus sui linfociti T, che altrimenti si dovrebbe verificare in poche settimane. Altre considerazioni mettono in discussione una diretta patogenesi virale nell'Aids. Per esempio, il virus herpes di tipo VI ha in vitro un'attività litica sui linfociti T maggiore di HIV ma non causa immunodepressione. Inoltre, i linfociti T di alcune scimmie sono suscettibili in vitro ed in vivo all'infezione da HIV, ma non sviluppano malattia. L'analisi strutturale delle proteine virali ha messo in evidenza alcune similitudini tra le sequenze virali (gp120, gp41, Nef, p24) e quelle di alcune proteine espresse sui linfociti T facenti parte del Complesso Maggiore di Istocompatibilità (Major Histocompatibility Complex, MHC). Tra l'altro queste proteine (come dice lo stes

so nome) sono responsabili del rigetto dei trapianti avendo un alto polimorfismo che marca l'individualità di ciascuno di noi. Recentemente Silvia Morante e Valerio Parisi (Dipartimento di Fisica) hanno sviluppato un algoritmo che facilita l'analisi di queste similitudini di sequenza, e tramite questo hanno identificato almeno due sequenze presenti sulla glicoproteina virale (gp120) con una similitudine altamente significativa dal punto di vista statistico con la catena B delle molecole MHC. Una di queste sequenze omologhe è in grado di potenziare la presentazione antigenica e la conseguente attivazione dei linfociti T, favorendo quindi la replicazione virale, che per i retrovirus è strettamente dipendente dall'attivazione della cellula ospite. Alla luce di queste osservazioni è stato proposto un meccanismo di evoluzione convergente tra HIV ed i linfociti T umani che proprio basandosi sulle molecole MHC possa spiegare la suscettibilità della specie umana all'infezione da HIV. Queste osservazioni sulle simili

tudini strutturali e funzionali tra HIV e proteine MHC è compatibile con l'ipotesi che la patogenesi dell'Aids non sia solamente ascrivibile agli effetti diretti del virus ma possa anche risiedere nello stesso sistema immunitario. Molti dei sintomi clinici e di laboratorio dell'Aids si ritrovano in malattie autoimmuni (la cui etiopatogenesi ancora sconosciuta viene di tanto in tanto ipotizzata essere di natura retrovirale), e nella malattia che si verifica in seguito a trapianto midollare, causata dall'attacco dei linfociti del donatore contro i linfociti del ricevente (Graft versus Host Desease). Queste patologie sono caratterizzate da produzione di autoanticorpi, declino del numero di linfociti T CD4, comparsa di molecole di attivazione e di stress cellulare. Per esempio è stata particolarmente interessante l'osservazione di Silvia Di Cesare e Fabrizio Poccia (Dipartimento di Biologia) sull'espressione di proteine da shock sulla membrana di linfociti T infettati con HIV. Nel Dipartimento di Biologia si sta

nno inoltre caratterizzando i meccanismi cellulari che portano alla morte di linfociti T, con particolare riguardo al ruolo dell'apoptosi. Come apoptosi si definisce il fenomeno fisiologico di morte cellulare che in concerto con la proliferazione determina l'omeostasi dei tessuti sia in condizioni normali che patologiche. Cellule normali o tumorali che vanno incontro a morte per apoptosi presentano caratteristiche molecolari e morfologiche comuni. Sebbene gli eventi biochimici che sono alla base di questo fenomeno non sono ancora completamente noti è ormai accertato che questo evento è regolato da un particolare programma genetico che controlla l'espressione di un corredo specifico di geni effettori. L'apoptosi svolge un ruolo chiave nel sistema immunitario; infatti, la selezione clonale che è alla base della sua maturazione avviene attraverso l'eliminazione delle cellule autoreattive o immunodeficienti per mezzo dell'apoptosi. Recentemente è stata formulata una ipotesi che indica nell'apoptosi il meccanismo

cellulare responsabile della morte dei linfociti T in pazienti affetti da Aids. L'ipotesi si basa sul fatto che la delezione dei linfociti T possa essere innescata (anche in linfociti non infetti) dall'interazione a livello della superficie cellulare tra il recettore CD4 e la proteina del virus gp120. Conferma sperimentale a tale ipotesi è stata recentemente ottenuta nel nostro laboratorio analizzando gli effetti dell'interazione tra gp120 e CD4 in termini di innesco del programma di morte per apoptosi in linfociti T normali. Questi dati indicano quindi che la patogenesi dell'HIV potrebbe non essere determinata dall'infezione virale per se, ma piuttosto essere generata dall'interferenza operata da alcune proteine virali nei normali meccanismi di riconoscimento tra cellule immunocompetenti. Due recenti osservazioni effettuate in modelli sperimentali animali ulteriormente spingono l'ipotesi sulla patogenesi immunitaria dell'Aids. Il primo riguarda l'osservazione effettuata in collaborazione con Valter Lombard

i e Paolo Rossi (Dipartimento di Sanità Pubblica) e Maurizio Mattei (Allevamento Cave - Tech di Roma) che topi del ceppo MRL/Ipr producano anticorpi specifici in grado di neutralizzare il virus in vitro riconoscendo gli stessi peptidi di gp120 immunodominanti nell'infezione umana. Questa osservazione è particolarmente rilevante considerando: a) che i topi non sono suscettibili all'infezione da HIV; b) che i topi MRL/Ipr sono un ceppo che con l'età sviluppa una sindrome autoimmunitaria non dissimile da altre malattie autoimmuni umane. La seconda osservazione è stata fatta in Inghilterra nel corso di esperimenti di vaccinazione dei macachi con virus SIV (Simian Immunodeficiency Virus), un virus strettamente correlato all'HIV che causa in alcune scimmie una sindrome simile all'Aids. Macachi vaccinati con virus SIV cresciuto su cellule umane ed inattivato risultano protetti verso una successiva infezione letale con SIV. L'osservazione inaspettata è che anche i macachi di controllo vaccinati con cellule umane sen

za SIV risultavano ugualmente protetti e producenti anticorpi anti - SIV.

3. Vaccini sperimentali e prospettive di controllo dell'infezione.

Il rapporto diretto tra etiologia e patogenesi dell'infezione da HIV ha fatto sostenere alla maggior parte dei ricercatori, e quindi acquisire all'opinione pubblica, che sia l'etiologia che la patogenesi dell'Aids siano direttamente correlate all'HIV (etiopatogenesi virale). Con questo assunto, risulta logico e naturale che lo sviluppo di un vaccino imbocchi un percorso iniziato 100 anni fa da Louis Pasteur e consolidato dai successi ottenuti nel controllo di altre infezioni virali quali quelli causate dall'ormai scomparso virus del vaiolo o dal virus della poliomielite. Questa strada comporta l'identificazione di proteine virali che inducano una risposta immunitaria protettiva, in grado cioè di bloccare la replicazione virale. La stragrande maggioranza delle vaccinazioni vengono effettuate prima dell'infezione, l'unica eccezione essendo rappresentata dalla vaccinazione contro il virus della rabbia, che per essere efficace deve essere effettuata nei primissimi momenti dell'infezione. Tuttavia considerando ch

e il virus HIV appartiene alla famiglia dei retrovirus, la prima domanda che ci si pone è se sia possibile arrivare ad una completa eradicazione dell'infezione in individui infetti con un virus che si integra in maniera autonoma nel genoma umano. Inoltre, le recenti considerazioni sul ruolo del sistema immunitario nella patogenesi dell'Aids hanno riaperto un dibattito non solo teorico ma anche uno pratico per lo sviluppo vaccini efficaci, Considerando la difficoltà ad eradicare l'infezione con un retrovirus, la seconda domanda è se sia possibile controllare almeno la patogenesi immunitaria che segue l'infezione con HIV, interferendo con le sequele di interazioni autoimmuni indotte dal virus. Queste osservazioni sul ruolo del sistema immunitario, ed in particolare sulle molecole MHC, nella risposta immune contro HIV sono state discusse in termine di protezione e patogenesi in un apposito convegno organizzato dal nostro Dipartimento con il British Council e svoltosi a Tor Vergata e all'isola di Ponza lo scorso

autunno.

Più recentemente, in una conferenza svolta a Tor Vergata dal Prof. Hans Wigzell del Karolinska Institute di Stoccolma e Presidente del Comitato dell'Organizzazione Mondiale della Sanità sullo Sviluppo dei Vaccini contro l'Aids, sono state sottolineate le strategie che i ricercatori e le industrie biotecnologiche stanno scegliendo per approntare un vaccino contro l'Aids. Una strategia consiste nello sviluppo di vaccini terapeutici per impedire la progressione della malattia in individui già infetti. La seconda si occupa di vaccini preventivi in grado di indurre una risposta immunitaria protettiva per individui sieronegativi esposti ad un alto rischio di infezione. Circa 20 sono le industrie biotecnologiche (purtroppo dobbiamo constatare l'assenza dell'Italia in questo settore) che hanno iniziato una gara nell'identificare e sviluppare un vaccino efficace facendo dire a Stephen Edgington "Nessuno vuole l'Aids ma... tutti vogliono un pezzo di HIV". Un problema rilevante in ambedue le strategie che sono alla bas

e dello sviluppo di vaccini efficaci è rappresentato dalla grande variabilità del virus HIV. Tale variabilità è documentata dal fatto che ogni individuo siropositivo presenta, anche contemporaneamente, clonotipi di virus immunologicamente diversi. La variabilità di HIV potrebbe essere importante nel sfuggire alla risposta immunitaria che si sviluppa nel corso dell'infezione. Questo aspetto della variabilità è affrontato nella nostra Università dal gruppo di Paolo Rossi nel modello di trasmissione materno - fetale dell'infezione da HIV. In collaborazione con Hans Wigzell ha recentemente evidenziato come i neonati che nascono da una madre sieropositiva sono infettati da un solo clonotipo di HIV sui più di 20 presenti nella madre. In conclusione, la strada per i vaccini è stata decisamente imboccata, sono stati evidenziati gli aspetti chiave che necessitano un maggiore chiarimento, quali la patogenesi della malattia e la variabilità del virus. Sono questi due problemi che ancora oggi non permettono di risponder

e alla domanda: a quando un vaccino contro l'Aids?